Teknologien muliggjør subcellulær 3D-avbildning av hele hjernehalvdelene

Den nye studien presenterer ikke et fullstendig kart eller atlas over hele hjernen, der hver celle, krets og protein blir identifisert og analysert. Men med full hemisfære-avbildning demonstrerer den en integrert pakke med tre teknologier for å muliggjøre denne og andre lenge ettersøkte nevrovitenskapelige undersøkelser. Forskningen gir et «proof of concept» ved å vise en rekke eksempler på hva rørledningen gjør mulig, inkludert store landskap med tusenvis av nevroner i hele hjerneregioner; flere skoger av celler, hver i individuelle detaljer; og klumper av subcellulære strukturer plassert mellom ekstracellulære molekyler. Forskerne presenterer også et rikt utvalg av kvantitative analytiske sammenligninger fokusert på en valgt region innenfor Alzheimers og ikke-Alzheimers hemisfærer.

Viktigheten av å kunne avbilde hele hjernehalvdelene intakte og ned til oppløsningen til individuelle synapser (de små forbindelsene som nevroner lager for å lage kretsløp) er todelt for å forstå den menneskelige hjernen i helse og sykdom, sier Chung.

En hjerne er bedre enn to

På den ene siden vil dette gjøre det mulig for forskere å utføre integrerte utforskninger av spørsmål ved hjelp av samme hjerne, i stedet for å måtte (for eksempel) observere forskjellige fenomener i forskjellige hjerner, som kan variere betydelig, og deretter prøve å bygge et sammensatt bilde av Sammen. system. Et nøkkeltrekk ved den nye teknologien er at analysen ikke bryter ned vev. I stedet gjør det vev ekstremt holdbart og gjentatte ganger ommerkbart for å fremheve forskjellige celler eller molekyler som trengs for nye studier, potensielt i årevis. I artikkelen demonstrerer Chungs team å bruke 20 forskjellige antistoffmerker for å fremheve forskjellige celler og proteiner, men de utvider allerede antallet til hundre eller mer.

«Vi trenger å kunne se alle disse forskjellige funksjonelle komponentene – cellene, deres morfologi og tilkobling, de subcellulære arkitekturene og deres individuelle synaptiske forbindelser – ideelt sett innenfor samme hjerne, med tanke på den høye individuelle variasjonen i den menneskelige hjernen og med tanke på det dyrebare naturen til menneskelige hjerneprøver, sier Chung. «Denne teknologipipelinen lar oss virkelig trekke ut alle disse viktige funksjonene fra den samme hjernen på en fullt integrert måte.»

På den annen side betyr den relativt høye skalerbarheten og gjennomstrømningen av prosessen (avbildning av en hel hjernehalvdel når den er klargjort tar 100 timer, i stedet for mange måneder) at mange prøver kan lages for å representere forskjellige kjønn, alder, sykdomstilstander, etc. og andre faktorer som kan tillate robuste sammenligninger med større statistisk kraft. Chung sier at han ser for seg å lage en bank av fullstendig forestilte hjerner som forskere kan analysere og ommerke etter behov for nye studier for å gjøre flere sammenligninger av den typen han og hans medforfattere har gjort med Alzheimers og ikke-Alzheimers halvkuler i den nye artikkelen.

Tre nøkkelinnovasjoner

Chung sier at den største utfordringen han møtte med å oppnå fremgangen beskrevet i artikkelen var å opprette et team ved MIT som inkluderte tre spesielt talentfulle unge forskere, hver med hovedforfatter på papiret på grunn av deres nøkkelroller i produksjonen av de tre viktigste. innovasjoner. Ji Wang, en maskiningeniør og tidligere postdoktor, utviklet «Megatome», en enhet for å kutte intakte halvkuler av den menneskelige hjernen så fint at de ikke blir skadet. Juhyuk Park, en materialingeniør og tidligere postdoktor, har utviklet kjemien som gjør hver del av hjernen klar, fleksibel, holdbar, utvidbar og raskt, jevn og gjentatt merkbar: en teknologi kalt «mELAST.» Webster Guan, en tidligere MIT kjemisk ingeniørstudent med evne til programvareutvikling, laget et beregningssystem kalt «UNSLICE» som sømløst kan sy sammen plater for å rekonstruere hver halvkule i full 3D, ned til nøyaktig justering av platene og nevroner. aksoner (de lange filamentene som strekker seg for å lage forbindelser med andre nevroner).

Ingen teknologi lar deg avbilde anatomien til hele den menneskelige hjernen med subcellulær oppløsning uten først å kutte den, fordi den er veldig tykk (det er 3000 ganger volumet til en musehjerne) og ugjennomsiktig. Men i Megatome forblir vevet intakt fordi Wang, som nå jobber i et selskap Chung grunnlagt kalt LifeCanvas Technologies, designet bladet sitt til å vibrere fra side til side raskere, og likevel sveipe bredere enn tidligere slicers vibratome. I mellomtiden laget han også instrumentet for å passe perfekt inn i planen hans, sier Chung. Resultatet er skiver som ikke mister anatomisk informasjon verken under separasjon eller andre steder. Og fordi vibratomen kutter relativt raskt og kan kutte tykkere (og derfor færre) vevsark, kan en hel halvkule kuttes på en dag, i stedet for måneder.

En av hovedårsakene til at byggeplassplater kan være tykkere stengler fra mELAST. Park designet hydrogelen som gjennomsyrer hjerneprøven for å gjøre den optisk gjennomsiktig, praktisk talt uforgjengelig, komprimerbar og utvidbar. Kombinert med andre kjemiske ingeniørteknologier utviklet i Chungs laboratorium de siste årene, kan prøver deretter bli jevnt og raskt infundert med antistoffetiketter som fremhever celler og proteiner av interesse. Ved å bruke et spesialbygget lysmikroskop fra laboratoriet er det mulig å avbilde en hel halvkule ned til individuelle synapser på omtrent 100 timer, rapporterer forfatterne i studien. Park er nå assisterende professor ved Seoul National University i Sør-Korea.

«Dette avanserte polymernettverket, som finjusterer de fysisk-kjemiske egenskapene til vev, har muliggjort multipleks multiskala avbildning av den intakte menneskelige hjernen,» sier Park.

Etter at hver plate er avbildet, er oppgaven å gjenopprette et intakt bilde av hele halvkulen. Guans UNSLICE gjør dette på flere skalaer. For eksempel, på medium- eller «meso»-skalaen, sporer den algoritmisk blodårer som kommer inn i et lag fra tilstøtende lag og matcher dem. Men det krever også en enda mer raffinert tilnærming. For ytterligere å registrere platene, merket teamet spesielt nærliggende nevrale aksoner i forskjellige farger (som ledninger i et elektrisk system). Dette tillot UNSLICE å matche lag basert på aksonsporing, sier Chung. Guan jobber nå også på LifeCanvas.

I studien presenterer forskerne en rekke eksempler på hva rørledningen kan gjøre. Den aller første figuren viser at bildebehandling lar oss merke en hel halvkule i detalj og dermed zoome inn på den store skalaen av hjernestrukturer på nivå med kretsløp, deretter individuelle celler og deretter subcellulære komponenter, som synapser. Andre bilder og videoer viser hvor mangfoldig merkingen kan være, og avslører lange aksonale forbindelser og overfloden og formen til forskjellige celletyper, inkludert ikke bare nevroner, men også astrocytter og mikroglia.

Utforsker Alzheimers

I årevis har Chung samarbeidet med medforfatter Matthew Frosch, en Alzheimer-forsker og direktør for hjernebanken ved Massachusetts General Hospital, for å avbilde og forstå hjernen til Alzheimers-pasienter. Når den nye rørledningen var etablert, begynte de en åpen utforskning, og la først merke til hvor innenfor en vevsplate de så det største tapet av nevroner i den syke prøven sammenlignet med kontrollen. Derfra fulgte de nysgjerrigheten deres – slik teknologien tillot dem – og produserte til slutt en serie detaljerte undersøkelser beskrevet i artikkelen.

«Vi satte ikke opp alle disse eksperimentene på forhånd,» sier Chung. «Vi startet bare med å si «OK, la oss ta bilde av denne platen og se hva vi ser.» Vi identifiserte områder i hjernen med betydelige nevronale tap, så la oss se hva som skjer der «La oss dykke dypere.»

«Denne rørledningen lar oss ha nesten ubegrenset tilgang til vevet,» sier Chung. «Vi kan alltid gå tilbake og se noe nytt.»

De fokuserte mesteparten av analysen på den orbitofrontale cortex innenfor hver halvkule. En av de mange observasjonene de gjorde var at synapsetap var konsentrert i områder der det var direkte overlapping med amyloidplakk. Utenfor plakkområdene var synapsetettheten like høy i hjerner med Alzheimers som hos de uten sykdommen.

Med bare to prøver, sier Chung, kommer teamet selvfølgelig ikke med noen konklusjoner om arten av Alzheimers sykdom, men poenget med studien er at det nå er muligheten til å avbilde og analysere hele hjernehalvdelene på en omfattende måte for å tillate akkurat den typen forskning.

Spesielt gjelder teknologien like godt for mange andre vev i kroppen, ikke bare hjernen.

«Vi forventer at denne skalerbare teknologiplattformen vil forbedre vår forståelse av menneskelige organfunksjoner og sykdomsmekanismer for å stimulere utviklingen av nye terapier,» konkluderer forfatterne.

I tillegg til Park, Wang, Guan, Chung og Frosch, er de andre forfatterne av artikkelen Lars A. Gjesteby, Dylan Pollack, Lee Kamentsky, Nicholas B. Evans, Jeff Stirman, Xinyi Gu, Chuanxi Zhao, Slayton Marx, Minyoung E. Kim, Seo Woo Choi, Michael Snyder, David Chavez, Clover Su-Arcaro, Yuxuan Tian, ​​​​Chang Sin Park, Qiangge Zhang, Dae Hee Yun, Mira Moukheiber, Guoping Feng, X. William Yang, C. Dirk Keene , Patrick R. Hof, Satrajit S. Ghosh og Laura J. Brattain.

Primærfinansiering for arbeidet kom fra National Institutes of Health, Picower Institute for Learning and Memory, JPB Foundation og NCSOFT Cultural Foundation.